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Gladys Rossi ha iniziato lo studio del canto nel 2002 e ha debuttato nel 2004 al Teatro di Busseto in Rigoletto nel ruolo di Gilda.
Al suo debutto hanno immediatamente fatto seguito esibizioni alla Konzerthalle di Amburgo, al Teatro Regio di Torino, al Teatro Regio di Parma, al Teatro Comunale di Bologna (La Bohème) al Teatro Municipale di Piacenza, a Cipro e nei Teatri di Tourcoing e Rennes in Francia.
Nel 2007 ha debuttato il ruolo della Regina della Notte nel Die Zauberflöte mozartiano a Bilbao. Nel 2008 è stata Violetta nella Traviata diretta da Tiziano Severini per la regia di Denis Krief.
Nel 2009 ha cantato in Carmen all'Arena di Verona diretta da Placido Domingo con la regia di Franco Zeffirelli ed ha partecipato, al Teatro La Fenice di Venezia, al Concerto di Gala per i quarant'anni di carriera di Katia Ricciarelli.
A Gennaio 2010 si è esibita in Falstaff, nel ruolo di Nannetta, al Teatro dell'Opera di Roma con la regia di Franco Zeffirelli. Nello stesso anno ha interpretato Violetta nella Traviata di Robert Carsen diretta da Myung Whun Chung al Teatro La Fenice di Venezia ed in seguito all'Opernhaus di Zurigo diretta da Carlo Rizzi al fianco di Leo Nucci.
A Marzo 2011, ancora a Venezia, ha interpretato Gilda in Rigoletto con la regia di Daniele Abbado e diretta da Diego Matheuz, successivamente, diretta da Gianluigi Gelmetti, ha interpretato Oscar in Un ballo in maschera al Festival Verdi di Parma.
Nel 2012 ha debuttato al Festival di Salisburgo presso la Haus für Mozart nel ruolo di Violetta. Ha cantato al fianco di Josè Carreras in occasione del Premio Giuseppe Di Stefano; sempre insieme al amestro Carreras si è esibita in concerto in Piazza di Spagna a Roma. Nello stesso anno ha interpretato, a Pechino, Oscar in Un ballo in maschera diretta da Lü Jia con la regia di Hugo De Ana e si è esibita in recital al Palau de la Mùsica Catalana di Barcellona.
Nel 2014 ha interpretato Hilda Mack in Elegie for young lovers di Hans Werner Henze presso il Teatro La Fenice di Venezia, diretta da Jonathan Webb con la regia di Pier Luigi Pizzi.
Nel Gennaio 2015 si è esibita con grande successo al Teatro Mariinsky di San Pietroburgo insieme a Josè Carreras nell'opera contemporanea El Juez composta da Christian Kolonovits.